賽默飛2720PCR儀反應(yīng)過程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制相似，但PCR的反應(yīng)體系要簡單的多，主要包括DNA靶序列、引物、4種單核苷酸dNTP、耐熱DNA聚合酶以及合適的緩沖液體系。

 

　　樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點的循環(huán)數(shù)）。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為zui大，這樣可以獲得準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。

 

　　在PCR擴(kuò)增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機(jī)分析處理系統(tǒng)，得出量化的實時結(jié)果輸出。

 

　　賽默飛2720PCR儀擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散是怎么回事？

 

　　1、降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。

 

　　2、酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。

 

　　3、若為PCR試劑盒則可能：①由于運(yùn)輸儲存不當(dāng)引起試劑盒失效；②試劑盒本身質(zhì)量有問題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。

 

　　4、退火溫度過低。

 

　　5、引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。

 

　　6、循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。

 

　　7、MgCl2濃度過高?？蛇m當(dāng)降低其用量。

 

　　8、模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。

 

　　9、電泳體系有問題：①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；②凝膠沒有凝固好；③瓊脂糖質(zhì)量差。

 

　　10、dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。